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  上海交通大學(xué)王偉銘團(tuán)隊(duì)：有前景的腎病治療新策略
  
  2024-10-29 來源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)
  
  10月23日，上海交通大學(xué)王偉銘研究團(tuán)隊(duì)在期刊《Cell Death Discovery》上發(fā)表了研究論文，題為“C/EBPα-mediated ACSL4-dependent ferroptosis exacerbates tubular injury in diabetic kidney disease”，本研究中，研究人員研究了轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α (C/EBPα)在DKD發(fā)病機(jī)制中的作用。腎活檢標(biāo)本分析顯示，DKD患者C/EBPα表達(dá)增高。通過RNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)，研究人員探索了C/EBPα在DKD中的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，C/EBPα通過促進(jìn)ACSL4依賴的鐵死亡來加重腎小管損傷。研究人員發(fā)現(xiàn)C/EBPα通過與ACSL4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（TRS）結(jié)合來上調(diào)ACSL4的表達(dá)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的升高。此外，抑制或基因敲除C/EBPα可減輕DKD中鐵死亡和腎小管損傷。這些結(jié)果表明，C/ ebp α- acsl4 -鐵死亡通路是DKD治療的一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)。
  
  背景信息
  
  糖尿病腎?。―KD）是一種作為糖尿病并發(fā)癥出現(xiàn)的腎臟疾病，給醫(yī)療保健帶來了巨大負(fù)擔(dān)。其特征是腎臟血管損傷，導(dǎo)致蛋白滲漏、高血壓和腎功能下降。雖然代謝紊亂和炎癥浸潤與DKD進(jìn)展有關(guān)，但驅(qū)動(dòng)其進(jìn)展的主要因素和潛在機(jī)制仍在研究中。
  
  近期的研究強(qiáng)調(diào)了C/EBPα（CCAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α）在DKD（礦物質(zhì)和骨質(zhì)代謝紊亂）進(jìn)展中的作用。C/EBPα是CEBP家族的成員，含有一個(gè)基本區(qū)域亮氨酸拉鏈（bZIP）結(jié)構(gòu)域，并根據(jù)CEBPA mRNA的翻譯起始位點(diǎn)產(chǎn)生兩種異構(gòu)體，p42和p30。p30異構(gòu)體主要抑制終末細(xì)胞分化，而p42異構(gòu)體調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。C/EBPα已知參與髓系細(xì)胞分化、急性髓系白血?。ˋML）以及各種代謝過程，盡管其詳細(xì)機(jī)制尚未完全闡明。
  
  鐵依賴性細(xì)胞死亡過程——鐵死亡（ferroptosis）的特點(diǎn)是脂質(zhì)過氧化物的積累。研究強(qiáng)調(diào)了脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)在保護(hù)DKD患者腎臟功能方面的重要性，其中ACSL4介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和活性氧（ROS）釋放是關(guān)鍵因素。
  
  特異性地敲除C/EBPα基因可減輕DKD小鼠的鐵死亡現(xiàn)象
  
  研究人員進(jìn)一步的研究涉及C/EBPα誘導(dǎo)劑ICCB280和RNA測(cè)序，提示C/EBPα可能參與了鐵死亡途徑。這一發(fā)現(xiàn)得到了DKD野生型小鼠觀察結(jié)果的支持，這些小鼠的線粒體出現(xiàn)皺縮，嵴結(jié)構(gòu)紊亂，并且出現(xiàn)了丙二醛（MDA）水平升高的現(xiàn)象。此外，與KO小鼠相比，DKD野生型小鼠中將谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）這種將二硫鍵還原為谷胱甘肽的關(guān)鍵酶的表達(dá)顯著降低。值得注意的是，各組GPX4 mRNA水平?jīng)]有顯著差異，這表明表達(dá)量降低是由于功能性降低而非轉(zhuǎn)錄調(diào)控。4-羥基壬烯（4-HNE）是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，免疫熒光染色顯示DKD野生型小鼠腎臟中4-HNE的熒光強(qiáng)度顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了C/EBPα在鐵死亡過程中的關(guān)鍵作用。
  
  C/EBPα缺乏通過下調(diào)ACSL4減輕了DKD中的鐵死亡
  
  為了探究C/EBPα對(duì)鐵死亡的影響所涉及的關(guān)鍵分子，研究人員對(duì)患有糖尿病腎病（DKD）的小鼠腎臟組織和未經(jīng)治療的Cre+/Cebpa+/+（野生型）小鼠腎臟組織進(jìn)行了串聯(lián)質(zhì)譜（TMT）蛋白質(zhì)組分析。研究人員重點(diǎn)關(guān)注與鐵死亡途徑相關(guān)的蛋白質(zhì)，并鑒定出在DKD中升高的蛋白質(zhì)。所得的熱圖顯示，在DKD小鼠的腎臟組織中，關(guān)鍵酶ACSL4（由C/EBPα調(diào)節(jié)，參與PUFA-CoA形成）的蛋白質(zhì)水平顯著升高。對(duì)中長鏈脂肪酸的代謝組分析顯示，DKD野生型小鼠腎臟中的亞油酸（ACSL4的底物）水平降低，而DKD敲除小鼠腎臟中的亞油酸水平升高，這表明ACSL4表達(dá)在腎臟中存在相反的影響。這些發(fā)現(xiàn)通過蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析得到驗(yàn)證，結(jié)果顯示敲除小鼠腎臟中的ACSL4蛋白水平明顯低于野生型小鼠。此外，qPCR和免疫熒光染色證實(shí)，DKD野生型小鼠腎臟中ACSL4 mRNA表達(dá)和平均熒光強(qiáng)度顯著增加，而在DKD敲除小鼠中，水平保持穩(wěn)定且較低。
  
  C/EBPα 過表達(dá)通過上調(diào) ACSL4 加劇了 DKD 小鼠的鐵死亡
  
  為了研究C/EBPα在腎臟皮質(zhì)中的過表達(dá)對(duì)糖尿病腎病的影響，研究人員利用AAV9載體建立了Cebpa過表達(dá)動(dòng)物模型，并評(píng)估其對(duì)DKD小鼠腎臟功能的影響。研究結(jié)果顯示，AAV9-Cebpa載體注射導(dǎo)致DKD小鼠Cebpa和Acsl4 mRNA水平升高，同時(shí)伴有尿素氮、血清肌酐、UACR和MDA濃度升高。此外，研究人員觀察到AAV9-Cebpa組小鼠有更嚴(yán)重的腎臟損傷、纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤。另外，Cebpa過表達(dá)小鼠腎臟中Lcn2、纖維化相關(guān)因子的mRNA表達(dá)顯著增加，Acsl4、纖維連接蛋白和4-HNE水平顯著升高。這些結(jié)果表明，在腎臟皮質(zhì)中上調(diào)C/EBPα調(diào)節(jié)Acsl4表達(dá)并加劇鐵死亡，從而導(dǎo)致DKD小鼠腎臟損傷。
  
  C/EBPα缺乏通過下調(diào)ACSL4減輕PTECs中的鐵死亡
  
  研究人員對(duì)WT和KO小鼠的PTEC進(jìn)行了檢測(cè)，觀察到KO PTEC中CEBPA和ACSL4的蛋白質(zhì)和mRNA水平顯著降低。此外，在RSL-3刺激下，KO PTEC的細(xì)胞存活率更高。在30 mM D-葡萄糖的刺激下，KO PTEC中谷胱甘肽（GSH）的水平升高，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的C11-BODIPY和Liperofluo的熒光強(qiáng)度降低。與WT PTEC相比，KO PTEC在AGE刺激下的C11-BODIPY熒光強(qiáng)度降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，C/EBPα在調(diào)節(jié)PTEC中的ACSL4表達(dá)和鐵死亡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，C/EBPα敲除可提供對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)。
  
  C/EBPα通過上調(diào)ACSL4誘導(dǎo)管狀上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡
  
  為了進(jìn)一步驗(yàn)證假設(shè)，研究人員使用ICCB280誘導(dǎo)PTECs中C/EBPα的表達(dá)。qPCR分析顯示，在50 μM ICCB280刺激下，PTECs中Cebpa和Acsl4 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。細(xì)胞存活性試驗(yàn)表明，PTECs在ICCB280處理后表現(xiàn)出劑量依賴性的存活率降低，在50 μM ICCB280處理組中觀察到的存活率降低了50%。使用Liperofluo（一種專門用于脂質(zhì)過氧化的探針）和C11-BODIPY（一種脂質(zhì)過氧化探針）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在ICCB280刺激后，兩種探針的平均熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)了顯著變化。此外，ICCB280治療顯著降低了PTECs中的GSH濃度，并顯著增強(qiáng)了MitoSOX的熒光強(qiáng)度，表明發(fā)生了鐵死亡。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)，在C/EBPα誘導(dǎo)下，PTECs的4-HNE產(chǎn)生量高于DMSO對(duì)照組。
  
  C/EBPα通過上調(diào)ACSL4誘導(dǎo)管狀上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡
  
  結(jié)論
  
  總之，本研究揭示了C/EBPα在DKD中通過直接與ACSL4轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合來調(diào)節(jié)其表達(dá)而發(fā)揮的新作用，從而導(dǎo)致腎小管損傷。巖藻甾醇可以抑制C/EBPα，這意味著它是預(yù)防DKD腎功能衰竭的一種新的靶點(diǎn)。
  
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