金鐵峰/張美花團隊：潛在的乳腺癌生物標志物和治療靶點
8月28日，延邊大學金鐵峰/張美花研究團隊在期刊《Cell Death&Disease》上發(fā)表了研究論文，題為“LncRNA HAGLROS promotes breast cancer evolution through miR-135b-3p/COL10A1 axis and exosome-mediated macrophage M2 polarization”，本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNA HAGLROS在乳腺癌組織和血漿外泌體中高度表達，其高表達與乳腺癌患者的不良預后有關。功能上，乳腺癌細胞來源的外泌體lncRNA HAGLROS通過誘導TAM/M2極化促進乳腺癌細胞增殖、遷移、上皮間質轉化（EMT）過程和血管生成。機制上，lncRNA HAGLROS與miR-135-3p競爭結合，防止其靶基因COL10A1的降解。總之，這些結果表明lncRNA HAGLROS/miR-135b-3p/COL10A1軸促進乳腺癌進展，揭示了乳腺癌細胞與TAM之間的交互通訊機制，表明lncRNA HAGLROS可能是乳腺癌的潛在生物標志物和治療靶點。
背景知識
乳腺癌是女性常見的癌癥，也是女性癌癥死亡的主要原因。根據(jù)新的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2020年，女性乳腺癌的發(fā)病率已超過肺癌，成為全球范圍內常見的癌癥類型。在女性中，乳腺癌在發(fā)病率和死亡率方面均排名第一，對女性的健康構成了嚴重威脅。盡管在不同亞型乳腺癌的早期診斷和治療方面取得了進展，但晚期和轉移性乳腺癌患者的預后仍然不佳。因此，尋找有效的生物標志物對于乳腺癌患者的治療具有重要的臨床意義。
人類基因組中只有不到2%的部分被轉錄為編碼RNA，而超過98%的部分被轉錄為非編碼RNA（ncRNA），這表明人類基因組中儲存了大量ncRNAs。lncRNA是一種長度超過200個核苷酸的ncRNA，由于缺乏有效的開放閱讀框（ORF）而不具備編碼蛋白質的能力。一些研究發(fā)現(xiàn)，異常表達的lncRNA與多種腫瘤的發(fā)生密切相關。miRNA是一種內源性的非編碼單鏈小RNA，長度約為18-22個核苷酸，廣泛存在于真核生物中，它通過堿基互補配對與mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結合，在轉錄后水平促進靶mRNA的降解或翻譯抑制，從而影響腫瘤的進展。研究表明，lncRNA通過多種機制影響腫瘤的進展，作為競爭性內源性RNA（ceRNA）與miRNA競爭性結合以影響mRNA表達是當前研究的熱點話題。lncRNA HCG18通過吸附miR-29a/b來上調TRAF4/TRAF5表達，從而促進上皮性卵巢癌的增殖、遷移和EMT過程。然而，大多數(shù)在乳腺癌中異常表達的lncRNA作為ceRNA的功能和機制尚不清楚。
乳腺癌細胞來源的lncRNA HAGLROS通過p-STAT3信號通路誘導TAM/M2極化
為了探究lncRNA HAGLROS與乳腺癌微環(huán)境之間的潛在機制，研究人員從乳腺癌細胞培養(yǎng)上清液中分離出外泌體進行驗證。qRT-PCR結果顯示，與乳腺上皮細胞外泌體相比，乳腺癌細胞外泌體中l(wèi)ncRNA HAGLROS的表達顯著升高。透射電子顯微鏡觀察到外泌體直徑約為100 nm，呈碟形結構。NTA結果顯示外泌體粒子直徑為126.8 nm。蛋白質免疫印跡實驗結果顯示，來自乳腺癌細胞的外泌體上表達有外泌體標記物TSG101和CD9。為了明確lncRNA HAGLROS是否能包裹在外泌體中，研究人員從表達lncRNA HAGLROS不同的乳腺癌細胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體。qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，過表達lncRNA HAGLROS的外泌體中l(wèi)ncRNA HAGLROS的表達顯著上調，反之亦然。這些結果表明lncRNA HAGLROS被包裹在外泌體中。為了探究外泌體是否能夠被巨噬細胞攝取并調節(jié)TAMs極化，將PKH26標記的外泌體（10 μg/mL）與THP-1細胞共孵育，熒光顯微鏡觀察顯示PKH26標記的外泌體能夠被THP-1細胞攝取。隨后，將THP-1細胞與表達lncRNA HAGLROS的乳腺癌細胞來源的外泌體共培養(yǎng)。qRT-PCR、蛋白質免疫印跡實驗和流式細胞術結果顯示，表達lncRNA HAGLROS的外泌體顯著下調TAM/M1標志物（CD86和iNOS）的表達水平，同時上調lncRNA HAGLROS和TAM/M2標志物（CD206、CD163、Arg-1）的表達水平，反之亦然。為了進一步驗證體外實驗的結果，研究人員收集了乳腺癌患者的血漿外泌體和乳腺癌組織進行qRT-PCR和IHC實驗，結果顯示，乳腺癌血漿外泌體中l(wèi)ncRNA HAGLROS的表達水平高于健康個體血漿外泌體，而乳腺癌組織中CD86的表達水平低于癌旁組織，CD206的表達則相反。這些結果表明，來自乳腺癌細胞的外泌體lncRNA HAGLROS抑制TAM/M1極化并促進TAM/M2極化。
外泌體lncRNA HAGLROS促進TAM/M2極化
為了進一步探究外泌體lncRNA HAGLROS調控TAM/M2極化的分子機制，研究人員研究了與免疫相關的信號通路，包括CEBPβ、MAPK和STAT信號通路，它們都參與TAM/M2極化。蛋白質免疫印跡實驗結果顯示，外泌體lncRNA HAGLROS對p-ERK、p-STAT6和CEBPβ的蛋白表達水平沒有影響。然而，在高表達lncRNA HAGLROS的外泌體處理后，p-STAT3的表達水平顯著上調。隨后，用不同濃度的STAT3抑制劑和激動劑處理巨噬細胞。通過蛋白質免疫印跡實驗檢測pSTAT3和STAT3的表達，并篩選出0.8 μM的STAT3抑制劑和4 nM的激動劑用于后續(xù)實驗。蛋白質免疫印跡實驗結果顯示，STAT3抑制劑恢復了外泌體lncRNA HAGLROS上調所促進的TAM/M2相關標志物的表達，反之亦然。這些結果表明，乳腺癌細胞來源的外泌體lncRNA HAGLROS通過激活p-STAT3信號通路促進TAM/M2極化。
研究小結
綜上，lncRNA HAGLROS在乳腺癌中高度表達，并預測患者預后不良，促進乳腺癌細胞的生物學行為。lncRNA HAGLROS通過靶向miR-135b-3p/COL10A1軸促進乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲、上皮間質轉化過程和血管生成。同時，乳腺癌細胞來源的外泌體lncRNA HAGLROS通過p-STAT3途徑誘導TAM/M2極化，增強乳腺癌細胞的惡性演變。這項研究闡明了lncRNA HAGLROS/miR-135b-3p/COL10A1信號通路與乳腺癌發(fā)展密切相關，外泌體在乳腺癌TME中發(fā)揮重要作用，通過傳遞lncRNA HAGLROS成為乳腺癌診斷和預后的新型分子標志物，并為乳腺癌靶向治療提供了新的靶點。
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