8月27日，同濟(jì)大學(xué)向作林教授團(tuán)隊(duì)在期刊《Cell Death&Disease》上發(fā)表了研究論文，題為“Circ-0044539 promotes lymph node metastasis of hepatocellular carcinoma through exosomal-miR-29a-3p”，本研究中，研究人員通過(guò)微陣列分析和生物信息學(xué)分析，確定circ-0044539-miR-29a-3p-VEGFA軸是HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)展的潛在關(guān)鍵因素。在肝癌細(xì)胞和裸鼠中，circ-0044539表達(dá)下調(diào)或miR-29a-3p表達(dá)上調(diào)與腫瘤體積小、PI3K-AKT-mTOR通路失活、關(guān)鍵淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移因子(HIF-1α和CXCR4)表達(dá)下調(diào)相關(guān)。此外，circ-0044539還負(fù)責(zé)外泌體miR-29a-3p的分泌。外泌體miR-29a-3p可遷移至淋巴結(jié)并下調(diào)多形核髓源性抑制細(xì)胞(PMN-MDSCs)中高遷移率族轉(zhuǎn)錄因子1 (Hbp1)的表達(dá)，誘導(dǎo)形成適合腫瘤定植的微環(huán)境。綜上所述，circ-0044539通過(guò)外泌體促進(jìn)HCC細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力，并在淋巴結(jié)中誘導(dǎo)免疫抑制環(huán)境，突出了其作為HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HCC免疫治療靶點(diǎn)的潛力。
背景知識(shí)
肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝臟腫瘤，全球發(fā)病率高，在癌癥相關(guān)死亡率方面排名第二，僅次于胰腺癌。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是HCC最常見(jiàn)的肝外轉(zhuǎn)移類型之一，極大地影響了HCC患者的生存和生活質(zhì)量。盡管HCC的診斷和治療取得了顯著的進(jìn)步，但由于患者癥狀較輕，難以發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特異性生物標(biāo)志物和潛在機(jī)制仍不清楚。因此，迫切需要全面闡明參與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以完善HCC患者的干預(yù)和診斷策略。
環(huán)狀RNA(Circular RNAs, circRNAs)由于其獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出高度的保守性和穩(wěn)定性，使其成為血清中潛在的分子生物標(biāo)志物。circRNAs被發(fā)現(xiàn)與HCC發(fā)病的多種機(jī)制相關(guān)，包括免疫抑制環(huán)境的形成、血管生成、基質(zhì)重塑、缺氧、細(xì)胞外囊泡的釋放和放化療抵抗。circRNAs作為無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物的巨大潛力及其在靶向治療中的臨床價(jià)值已受到廣泛關(guān)注。然而，circRNAs在HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的具體作用尚不清楚。本研究旨在驗(yàn)證circ-0044539在HCC中的生物學(xué)作用，探討其參與HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的新型臨床診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供理論支持。
髓源性抑制細(xì)胞(myeloid -derived suppressor cells, MDSCs)是在骨髓中產(chǎn)生的一群異質(zhì)性髓系細(xì)胞。在荷瘤宿主中，MDSCs向外周淋巴器官和腫瘤遷移，促進(jìn)局部免疫抑制微環(huán)境的形成。不同腫瘤組織和器官中MDSCs的表型存在顯著差異，這表明MDSCs的分化和聚集可能是腫瘤細(xì)胞依賴的。這表明血液和免疫器官(如淋巴結(jié))中的MDSCs可能受到癌細(xì)胞的調(diào)控。雖然MDSCs在LN和HCC組織中的抑制作用已被證實(shí)，但在HCC到來(lái)之前，MDSCs與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍未被探索。
Circ-0044539在體外促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲
Circ-0044539在高侵襲轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6細(xì)胞株中的表達(dá)水平高于低侵襲轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97L細(xì)胞株。與正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞株相比，這些肝癌細(xì)胞株的circ-0044539表達(dá)水平較高。此外，circ-0044539表現(xiàn)出對(duì)RNase R處理的抗性，而COL1A1的線性亞型則沒(méi)有。其穩(wěn)定性也高于COL1A1 mRNA。過(guò)表達(dá)circ-0044539后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，而抑制circ-0044539后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了circ-0044539在肝癌細(xì)胞中的致癌作用。
MiR-29a-3p在體外抑制肝癌的惡性行為，逆轉(zhuǎn)circ-0044539誘導(dǎo)的促腫瘤作用
為了驗(yàn)證假設(shè)，研究人員構(gòu)建了miR-29a-3p敲低和過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，盡管miR-29a-3p的上調(diào)或下調(diào)，但circ-0044539的表達(dá)沒(méi)有受到影響。miR-29a-3p有效地抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，顯著降低了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。miR-29a-3p的下調(diào)激活了PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，并增加了HIF-1α和CXCR4的蛋白表達(dá)水平。此外，VEGFA可以減輕由miR-29a-3p介導(dǎo)的這些效應(yīng)。
雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)circ-0044539與miR-29a-3p存在直接相互作用。為了進(jìn)一步研究circ-0044539-miR-29a-3p軸在HCC進(jìn)展中的作用，研究人員進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)circ-0044539可能與培養(yǎng)條件、細(xì)胞密度和細(xì)胞倍增時(shí)間相關(guān)，影響肝癌細(xì)胞系中miR-29a-3p的表達(dá)水平。挽救實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)circ-0044539對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的促進(jìn)作用可被miR-29a-3p逆轉(zhuǎn);敲低circ-0044539介導(dǎo)的抑制作用可被抑制miR-29a-3p逆轉(zhuǎn)。如圖1G所示，circ-0044539增加了PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的磷酸化水平，增加了HIF-1α和CXCR4的蛋白表達(dá)，這些作用被miR-29a-3p逆轉(zhuǎn)。綜上所述，這些結(jié)果表明miR-29a-3p表現(xiàn)出抗癌作用，并通過(guò)直接結(jié)合circ-0044539在HCC中部分介導(dǎo)了其致癌功能。
圖1：Circ-0044539在體外通過(guò)miR-29a-3p調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力
血清circ-0044539和血漿外泌體miR-29a-3p是HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特異性生物標(biāo)志物
研究人員評(píng)估了124例HCC患者的血清circ-0044539濃度，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組血清circ-0044539顯著高于淋巴結(jié)非轉(zhuǎn)移組。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)血漿外泌體中miR-29a-3p的水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HCC患者中顯著升高。循環(huán)circ-0044539和外泌體miR-29a-3p可能是診斷HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物。
研究小結(jié)
總之，本研究表明，circ-0044539可以影響HCC細(xì)胞和LN微環(huán)境，從而促進(jìn)HCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Circ-0044539通過(guò)miR-29a-3p增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。在HCC細(xì)胞中，circ-0044539通過(guò)hif -1α依賴通路上調(diào)CXCR4的表達(dá)并促進(jìn)富含miR-29a-3p的細(xì)胞外泌體的釋放。這些外泌體影響PMN-MDSCs中Hbp-1的表達(dá)，從而增強(qiáng)PMN-MDSCs的免疫抑制功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確表明，高表達(dá)circ-0044539的肝癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體靶向淋巴結(jié)，形成促進(jìn)肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移前淋巴結(jié)微環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)circ-0044539在組織和血清中的表達(dá)可能是HCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物。這些結(jié)果表明，原發(fā)性肝癌細(xì)胞通過(guò)獲得較高的circ-0044539表達(dá)水平，不僅獲得了選擇性的生存優(yōu)勢(shì)，還具有向特定器官遷移的傾向：淋巴結(jié)，這可能導(dǎo)致遠(yuǎn)處擴(kuò)散和免疫抑制。
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