西南醫(yī)科大學發(fā)文：發(fā)現(xiàn)肝癌治療新靶點
8月6日，西南醫(yī)科大學研究團隊在期刊《Molecular Cancer》上發(fā)表了研究論文，題為“Circular RNA ACVR2A promotes the progression of hepatocellular carcinoma through mir-511-5p targeting PI3K-Akt signaling pathway”，本研究采用定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)或蛋白質印跡法(Western blot)測定circACVR2A、微小RNA (miR511-5p)和PI3K-Akt信號通路中相關蛋白的豐度。分別采用CCK-8、遷移實驗和Tunel染色分析細胞活力、侵襲和凋亡。雙熒光素酶報告基因實驗評估了circACVR2A與microRNA的相互作用。circACVR2A在肝癌細胞株中高表達。體內外實驗結果表明，circACVR2A促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在機制方面，研究人員發(fā)現(xiàn)circACVR2A可以直接與miR511-5p相互作用，并作為miRNA海綿調節(jié)PI3K-Akt信號通路中相關蛋白的表達。在HCC中，circACVR2A可通過介導miR-511-5p/mRNA網絡激活PI3K信號通路。這表明，以circACVR2A為核心的分子調控網絡是肝細胞癌診斷和治療的潛在新靶點。
研究背景
肝細胞癌極其致命，每年有70多萬人死于肝癌。我國每年約有40萬新發(fā)肝細胞癌患者，約占全球新增肝細胞癌患者的50%。由于肝細胞癌患者的高復發(fā)率和不良預后，尋找新的、更有效的生物標志物作為肝細胞癌的檢測靶點，或作為預防和治療靶點顯得尤為必要。
研究表明，circRNA在多種惡性腫瘤與正常組織之間存在穩(wěn)定的表達差異，因此有學者認為部分circRNA可作為惡性腫瘤的理想生物標志物。circRNA還參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等生理過程。例如，hsa_circ_002059在胃癌、正常組織和血液樣本中的表達存在顯著差異，也顯示出其作為生物標志物的潛在診斷價值。circ-ITCH在食管鱗狀細胞癌組織中的表達明顯低于癌旁組織。過表達circ-ITCH可顯著抑制腫瘤細胞周期進展，從而抑制腫瘤生長。然而，目前關于circRNA是否可以作為肝癌的診斷和治療靶點的研究較少。
circACVR2A可促進肝癌細胞增殖
研究人員通過CCK-8實驗和細胞克隆形成實驗探究circACVR2A是否影響肝癌細胞增殖。在過表達或敲低circACVR2A的肝癌細胞株Huh-7和Hep3B中，CCK8分別在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h檢測細胞活力。與對照組相比，過表達circACVR2A可顯著增強肝癌細胞Huh-7和Hep3B的細胞活力，而敲低circACVR2A會導致Huh-7和Hep3B細胞活力顯著下降。在細胞克隆形成實驗中，研究人員發(fā)現(xiàn)過表達circACVR2A增加了細胞克隆的數(shù)量，而沉默circACVR2A則減少了細胞克隆的數(shù)量，這表明circACVR2A在體外可以促進Huh-7和Hep3B細胞的腫瘤發(fā)生。
circACVR2A可促進肝癌細胞體外增殖
circACVR2A促進肝癌的侵襲和遷移
circACVR2A在肝癌細胞系Huh-7和Hep3B中過表達或敲低。研究人員通過細胞劃痕實驗和體外遷移細胞侵襲實驗檢測circACVR2A表達對肝癌細胞侵襲和遷移的影響。結果顯示，在遷移實驗中，與對照組相比，過表達circACVR2A細胞的生長速度明顯快于敲低circACVR2A細胞的生長速度。提示circACVR2A可促進肝癌細胞中Huh-7和Hep3B的遷移;侵襲實驗中，與對照組相比，過表達circACVR2A能促進更多的Huh-7和Hep3細胞通過遷移腔室，而敲低circACVR2A會導致較少的細胞通過遷移腔室。提示circACVR2A可促進肝癌細胞中Huh-7和Hep3B的侵襲。
circACVR2A可抑制肝癌細胞凋亡
研究人員采用TUNEL染色實驗檢測circACVR2A是否影響肝癌細胞凋亡。用circACVR2A過表達或沉默Huh-7和Hep3B后，制備細胞片，采用TUNEL染色試劑盒、TdT酶染色液和DAPI酶染色液進行染色。通過熒光顯微鏡觀察并拍照，根據(jù)TUNEL染色結果。TUNEL陽性染色呈紅色，形態(tài)和大小不一，以分散的形式隨機分布于正常細胞中。對照組幾乎無陽性細胞，過表達circACVR2A組幾乎無提示凋亡的紅色陽性細胞，兩組細胞間無明顯差異。而在敲低circACVR2A組(shRNA1和shRNA3)中，陽性細胞顯著增加，且高于各自的對照組。這提示抑制circACVR2A可促進Huh-7和Hep3B細胞的凋亡。
circACVR2A可激活PI3K信號通路
為進一步驗證circACVR2A可通過PI3K信號通路發(fā)揮致癌作用，研究人員采用蛋白質免疫印跡法檢測Huh-7和Hep3B細胞株過表達和沉默circACVR2A后PI3K信號通路相關蛋白的表達。結果顯示，過表達circACVR2顯著增強了PI3K、p-PI3K、p-AKT和p-FoxO1的表達，顯著抑制了FoxO1的表達，而沉默circACVR2A則呈現(xiàn)相反的結果。此外，研究人員還檢測了肝癌細胞株Huh-7和Hep3B中凋亡相關蛋白Bax/Bcl2的表達。在肝癌細胞株Huh-7和Hep3B中過表達circACVR2可顯著抑制Bax的表達，增強Bcl2的表達，而沉默circACVR2A后結果則相反。這表明circACVR2A介導的調控網絡可上調PI3K-AKT信號通路，發(fā)揮致癌作用。
circACVR2A可促進肝癌的體內生長
為了進一步驗證circACVR2A在體內對腫瘤生長的影響，研究人員構建了穩(wěn)定表達circACVR2A和其對照載體的Hep3B細胞，并根據(jù)細胞實驗結果選擇shRNA1沉默Hep3B細胞的circACVR2A敲低細胞。選擇約5-6周齡的裸鼠BALB/c，將過表達或敲低circACVR2A及其對照組的細胞注射到小鼠右側腋窩。細胞接種后一周，各組均出現(xiàn)腫瘤生長，每3天測量并記錄腫瘤體積。接種21天后，小鼠被處死，取出腫瘤組織并稱重。結果顯示，與對照組相比，circACVR2A過表達組腫瘤組織明顯出現(xiàn)壞死。此外，circACVR2A過表達組的腫瘤體積和重量顯著增加，而敲低組的腫瘤體積和重量與對照組相比顯著降低。研究人員采用HE染色檢測各組腫瘤的生長情況。結果顯示，過表達circACVR2A組的腫瘤壞死細胞面積顯著大于對照組，而敲低circACVR2A組的腫瘤壞死細胞面積顯著小于對照組。這表明在肝癌中下調circACVR2A表達可以抑制腫瘤的體內生長。
研究小結
總之，研究表明，circACVR2A在肝細胞癌細胞系中的表達上調，其高表達與肝細胞癌的進展密切相關。就機制而言，circACVR2A可通過直接與miR-511-5p結合，顯著抑制肝細胞癌的增殖和轉移，從而降低miR-511-5p對PI3K信號通路的抑制作用。因此，以circACVR2A為核心的分子調節(jié)網絡可能是治療肝癌的新靶點。
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