青光眼基因治療有望實(shí)現(xiàn)“單次給藥，長效降壓”
近日，中山大學(xué)中山眼科中心教授張秀蘭團(tuán)隊(duì)與劍橋大學(xué)教授Patrick Yu-Wai Man合作，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)靶向敲除碳酸酐酶2（Car2）基因，在小鼠模型上單次給藥獲得持續(xù)降低眼壓兩個月以上的顯著作用，為青光眼提供了廣譜、長效降低眼壓基因治療的可能性。相關(guān)成果發(fā)表于《細(xì)胞報道醫(yī)學(xué)》。
研究摘要圖。研究團(tuán)隊(duì)供圖
“我們打破了傳統(tǒng)基因治療研究框架，從臨床實(shí)際需求出發(fā)，尋找到適合所有青光眼類型的Car2基因進(jìn)行廣譜基因治療研究?！闭撐墓餐ㄓ嵶髡邚埿闾m表示，該研究成果具有極大的臨床轉(zhuǎn)化潛力，基因編輯藥物有望替代傳統(tǒng)藥物治療手段，實(shí)現(xiàn)“One shot gene therapy——單次給藥，長效降壓”的目標(biāo)，為所有類型的青光眼患者減輕疾病負(fù)擔(dān)。
青光眼是全球范圍內(nèi)第一大不可逆致盲性眼病?；蚓庉嬆軌蛱峁﹩未胃深A(yù)、長效治療的可能，是青光眼理想的治療工具。張秀蘭團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)3年多時間的潛心研究，從臨床降眼壓藥物的作用機(jī)制出發(fā)，尋找到適合所有青光眼類型的Car2基因進(jìn)行廣譜基因治療研究，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除Car2基因，通過單次玻璃體腔注射，在小鼠模型中獲得長達(dá)兩個月的降眼壓效果，為青光眼提供了廣譜基因療法的可能性。
張秀蘭團(tuán)隊(duì)首先針對小鼠Car2基因設(shè)計了六條sgRNA序列，并在體外利用T7E1實(shí)驗(yàn)結(jié)合深度測序技術(shù)評估各sgRNA的基因編輯效率。為了進(jìn)一步提高基因編輯效率，團(tuán)隊(duì)篩選出兩條sgRNA并構(gòu)建雙靶點(diǎn)CRISPR系統(tǒng)，結(jié)果表明基因編輯效率被顯著提升至97.3%。接著，為了驗(yàn)證Car2基因敲除是否能夠降低眼壓，該團(tuán)隊(duì)將雙靶點(diǎn)CRISPR系統(tǒng)包裝至ShH10血清型的腺相關(guān)病毒（AAV）載體中。ShH10-AAV對負(fù)責(zé)房水生成的睫狀體組織有很高的親和性。通過單次玻璃體腔注射，團(tuán)隊(duì)證明雙靶點(diǎn)CRISPR系統(tǒng)能夠靶向睫狀體組織，減少CAR2蛋白的表達(dá)。眼壓監(jiān)測結(jié)果也表明Car2基因敲除能夠顯著降低正常小鼠的基線眼壓，相較于對照組減少約3mmHg，并且持續(xù)兩個月以上。
為了進(jìn)一步探索Car2基因敲除對青光眼的治療效果，研究團(tuán)隊(duì)采用了DBA/2J小鼠和磁珠誘導(dǎo)慢性高眼壓模型兩種實(shí)驗(yàn)性青光眼模型。結(jié)果表明Car2基因敲除能夠顯著降低青光眼模型小鼠的眼壓，并且能夠延緩甚至阻止高眼壓帶來的組織學(xué)損傷。此外，在慢性高眼壓模型中，以臨床常用降眼壓藥物派立明（布林佐胺）滴眼液作對比，發(fā)現(xiàn)Car2基因敲除降眼壓效果要略優(yōu)于派立明，該發(fā)現(xiàn)極大促進(jìn)了基因編輯藥物替代傳統(tǒng)藥物治療青光眼的可能性。
盡管眼球憑借“免疫豁免”是理想的基因治療靶器官，但由于AAV病毒缺乏組織特異性，無法避免視網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)染，因此張秀蘭團(tuán)隊(duì)通過組織學(xué)和功能學(xué)評估Car2基因敲除的安全性和潛在副作用。OCT以及ERG結(jié)果表明，Car2基因敲除未引起潛在的不良反應(yīng)。
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