近日，四川大學(xué)華西醫(yī)院研究人員在期刊《Nature Communications》上發(fā)表了題為“A circular RNA activated by TGFβ promotes tumor metastasis through enhancing IGF2BP3-mediated PDPN mRNA stability”的研究論文，本研究中， 研究人員確定了TGFβ誘導(dǎo)的circRNA --circITGB6是TGFβ介導(dǎo)的EMT過程中不可或缺的因子。circITGB6在轉(zhuǎn)移性癌癥樣本中表達(dá)顯著上調(diào)，其高豐度與結(jié)直腸癌(CRC)患者預(yù)后不良密切相關(guān)。通過分析，研究人員發(fā)現(xiàn)circITGB6在體內(nèi)和體外的各種模型中都能有效地促進(jìn)EMT過程和腫瘤轉(zhuǎn)移。從機(jī)制上講，circITGB6通過直接與IGF2BP3相互作用，增強(qiáng)了EMT促進(jìn)基因PDPN 的mRNA的穩(wěn)定性。值得注意的是，用PEI包覆的特異性siRNA干擾circITGB6可以有效抑制肝轉(zhuǎn)移。本研究揭示了TGFβ調(diào)控的circRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中的功能，并提示靶向circITGB6是一種很有前景的癌癥治療策略。
研究背景
腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因，約占癌癥死亡的90%。在轉(zhuǎn)移的早期階段，一部分癌細(xì)胞經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，通過這種轉(zhuǎn)化，它們獲得了間充質(zhì)特征，從而具備了從原發(fā)部位擴(kuò)散和向遠(yuǎn)處器官移動的能力。一旦癌細(xì)胞從原發(fā)部位逃逸，轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞很難被根除，就會發(fā)展成無法治愈的疾病。因此，闡明腫瘤轉(zhuǎn)移過程的機(jī)制和確定可行的治療靶點(diǎn)是克服腫瘤轉(zhuǎn)移的當(dāng)務(wù)之急。
轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFβ)信號通路作為腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)，通過與其膜受體的特異性相互作用而被激活。激活的TGFβ通路通過誘導(dǎo)EMT過程，降低上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，增加間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和vimentin的表達(dá)，增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移能力。除了這些EMT標(biāo)記物，一種糖基化的跨膜蛋白podoplanin (PDPN)也通過促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移在EMT過程中發(fā)揮重要的功能效應(yīng)。此外，有研究報(bào)道PDPN的高表達(dá)與不同癌癥患者的生存期縮短相關(guān)。盡管PDPN可以在TGFβ的刺激下被誘導(dǎo)，但TGFβ和PDPN之間的詳細(xì)相互作用尚未被廣泛闡明。
越來越多的證據(jù)支持失調(diào)的環(huán)狀RNA(circRNA)在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。雖然circrna與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系近期被證實(shí)，但circrna在tgf β介導(dǎo)的EMT過程中的詳細(xì)意義仍不清楚?？紤]到在臨床評估中，TGFβ抑制劑作為抗轉(zhuǎn)移藥物的表現(xiàn)并不令人滿意，因此對這一問題的研究至關(guān)重要。
研究進(jìn)展
越來越多的證據(jù)表明，Circrna通過不同的機(jī)制參與不同的生物學(xué)過程。研究人員使用TransCirc和riboCIRC數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的生物信息學(xué)分析表明，由于缺乏假定的IRES元件，circITGB6編碼多肽的潛力有限，或者由于circITGB6對任何miRNAs的潛在結(jié)合位點(diǎn)不超過兩個，因此circITGB6可能作為蛋白質(zhì)誘餌發(fā)揮作用。
為了鑒定與circITGB6相互作用的蛋白，研究人員在細(xì)胞中引入了生物素化的正(S)或反義(AS) DNA寡聚體，然后通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)鑒定circITGB6結(jié)合的蛋白。在circITGB6的潛在相互作用蛋白中，以至高豐度(獨(dú)特肽= 25，覆蓋率= 48%)和較高評分(Score Sequest HT = 346.9)鑒定了一種RNA結(jié)合蛋白，胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白3 (IGF2BP3)(圖1b)。使用反義探針(圖1c)或體外轉(zhuǎn)錄和環(huán)狀的circITGB6(圖1d)驗(yàn)證了circITGB6與IGF2BP3的關(guān)聯(lián)。此外，使用抗IGF2BP3抗體的RNA免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了IGF2BP3和circITGB6之間的相互作用(圖1e)，其中CD44 mrna作為陽性對照。研究人員證實(shí)了內(nèi)源性circITGB6和IGF2BP3在A549細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)共定位，而不受circITGB6敲低或TGFβ應(yīng)激的影響。因此，本研究結(jié)果強(qiáng)烈支持circITGB6和IGF2BP3之間的相互作用不是細(xì)胞類型/組織特異性的。為了研究IGF2BP3是否參與circITGB6的促進(jìn)轉(zhuǎn)移作用，研究人員生成了兩個獨(dú)立的靶向IGF2BP3的shRNAs，并將其遞送到circITGB6- OE穩(wěn)定細(xì)胞中。結(jié)果表明，敲低IGF2BP3減弱了circITGB6對EMT標(biāo)志物表達(dá)(圖1g)和細(xì)胞遷移(圖1h)的影響。綜上所述，IGF2BP3可能作為circitgb6相關(guān)因子促進(jìn)EMT進(jìn)程和細(xì)胞遷移。
圖1：circITGB6與IGF2BP3相互作用促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移
鑒于circITGB6在腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用及其與癌癥進(jìn)展的相關(guān)性，研究人員想知道circITGB6是否可能成為促進(jìn)轉(zhuǎn)移腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)。為此，研究人員制備了特異性靶向circITGB6連接位點(diǎn)的siRNA，并驗(yàn)證了其對circITGB6而非ITGB6轉(zhuǎn)錄本的選擇性衰減作用(圖2e)。研究結(jié)果表明，通過siRNA靶向circITGB6是一種有前景的癌癥治療策略。
圖2：靶向circITGB6可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移
研究結(jié)論
在這項(xiàng)研究中，研究人員確定了一個來自ITGB6的高度保守的circRNA, circITGB6 (hsa_circ_0056856)，被TGFβ穩(wěn)健地誘導(dǎo)，并且在人類轉(zhuǎn)移性癌癥樣本中顯著上調(diào)。此外，circITGB6還能誘導(dǎo)EMT過程并促進(jìn)多種腫瘤的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。另外，circITGB6的促進(jìn)轉(zhuǎn)移作用很大程度上歸因于其與IGF2BP3直接相互作用以穩(wěn)定PDPN mRNA的能力，而PDPN mRNA編碼一個誘導(dǎo)EMT和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白。重要的是，體內(nèi)遞送PEI包覆的circITGB6 siRNA復(fù)合物顯著抑制肝轉(zhuǎn)移，并延長肝轉(zhuǎn)移小鼠的生存期。本研究結(jié)果表明，circITGB6是一個關(guān)鍵的TGFβ效應(yīng)因子和癌癥治療的潛在治療靶點(diǎn)。
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