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  重大發(fā)現(xiàn)！北京大學(xué)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)抑制結(jié)腸癌新靶點(diǎn)
  
  2023-07-07 來(lái)源：轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)
  
  在本研究中，lncRNA miR663AHG的亞細(xì)胞定位是通過(guò)RNA-FISH來(lái)確定的。采用qRT-PCR檢測(cè)miR663AHG和miR663a。體外和體內(nèi)研究miR663AHG對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。利用CRISPR/Cas9、RNA pulldown等生物學(xué)檢測(cè)方法探索miR663AHG的潛在機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)miR663AHG主要分布在Caco2和HCT116細(xì)胞的細(xì)胞核以及SW480細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
  
  119例患者結(jié)腸癌組織中miR663AHG的表達(dá)水平與miR663a的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r = 0.179, P = 0.015)，與配對(duì)的正常組織相比，miR663AHG的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P < 0.008)。miR663AHG低表達(dá)的結(jié)腸癌與pTNM晚期(P = 0.021)、淋巴轉(zhuǎn)移(P = 0.041)和較短的總生存期相關(guān)(風(fēng)險(xiǎn)比= 2.026;p = 0.021)。實(shí)驗(yàn)表明，miR663AHG抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。過(guò)表達(dá)miR663AHG的RKO細(xì)胞移植物在BALB/c裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度慢于載體對(duì)照細(xì)胞(P = 0.007)。有趣的是，無(wú)論是rna干擾還是白藜蘆醇誘導(dǎo)miR663AHG或miR663a的表達(dá)變化，都可以觸發(fā)miR663AHG基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)反饋調(diào)控。在機(jī)制上，miR663AHG可以結(jié)合miR663a及其前體pre-miR663a，阻止miR663a靶mrna的降解。通過(guò)敲除MIR663AHG啟動(dòng)子、外顯子1和pri- miR663a編碼序列來(lái)破壞負(fù)反饋，完全阻斷了MIR663AHG的這些作用，在轉(zhuǎn)染miR663a表達(dá)載體的細(xì)胞中恢復(fù)了MIR663AHG的這些作用。綜上所述，miR663AHG作為腫瘤抑制因子，通過(guò)與miR663a/pre-miR663a的順式結(jié)合抑制結(jié)腸癌的發(fā)展。miR663AHG和miR663a表達(dá)之間的串?dāng)_可能在維持miR663AHG在結(jié)腸癌發(fā)展中的功能中起主導(dǎo)作用。
  
  研究背景
  
  結(jié)腸癌是世界上死亡率僅次于肺癌的惡性疾病。預(yù)計(jì)到2022年，美國(guó)將有近10萬(wàn)名新診斷的結(jié)腸癌患者，死亡率將達(dá)到約8.6%。雖然DNA甲基化標(biāo)記篩查、結(jié)腸鏡檢查和結(jié)腸粘膜息肉切除術(shù)的普及在早期診斷和預(yù)防方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但50歲以下人群的結(jié)腸癌發(fā)病率仍在穩(wěn)步上升。對(duì)其機(jī)制的深入研究可能會(huì)加快結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制的闡明。
  
  隨著高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)從人類基因組中轉(zhuǎn)錄出大量的非編碼RNA (ncRNA)分子。長(zhǎng)鏈非編碼rna (lncRNAs)可以調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)象、基因轉(zhuǎn)錄、hnRNA剪接以及其他生物過(guò)程，如癌癥的發(fā)生。許多l(xiāng)ncrna在癌組織中的表達(dá)狀態(tài)異常。一些因素直接影響癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥和干細(xì)胞的干性。此外，ncrna具有組織特異性和腫瘤特異性表達(dá)模式，有望成為患者糞便、血清/血漿和組織樣本中潛在的結(jié)直腸癌篩查、診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。
  
  MIR663AHG是一個(gè)罕見的人類特異性基因(Entrez gene: 284801)，位于20號(hào)染色體的著絲粒上。該基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(hnRNA)可以同時(shí)剪接成microRNA miR663a和lncRNA miR663AHG。我們之前報(bào)道過(guò)miR663a在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR663a抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明miR663AHG表達(dá)的變化與椎間盤退變(IDD)的發(fā)生有關(guān)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR663AHG在銀屑病組織中下調(diào)。根據(jù)基因型-組織表達(dá)計(jì)劃(GTEx)項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫(kù)，miR663AHG在人類各種正常組織中普遍表達(dá)，并具有相對(duì)豐度。然而，miR663AHG的生物學(xué)功能此前未見報(bào)道。在本研究中，我們首次研究了miR663AHG在結(jié)腸癌發(fā)生中的作用及其分子機(jī)制。
  
  研究結(jié)果
  
  miR663AHG的表征及其亞細(xì)胞分布
  
  與蛋白質(zhì)編碼基因相比，ncRNA基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start sites, tss)更加多樣化。MIR663AHG是一個(gè)多外顯子基因。miR663a和miR663AHG是由相同的hnRNA拼接而成的。在PhyloCSF分析中，miR663AHG的值小于零，表明該lncRNA不編碼蛋白質(zhì)。
  
  lncRNA miR663AHG的表征
  
  整個(gè)患者隊(duì)列中研究參與者的人口學(xué)特征
  
  眾所周知，基因轉(zhuǎn)錄受轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss)周圍CpG島甲基化狀態(tài)的調(diào)控。一個(gè)CpG島位于MIR663AHG TSS周圍。根據(jù)CCLE DNA甲基化和RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘結(jié)果，高甲基化水平細(xì)胞系的miR663AHG和miR663a水平顯著低于中、低甲基化水平細(xì)胞系(P < 0.05)。這表明MIR663AHG基因的轉(zhuǎn)錄受DNA甲基化調(diào)控。
  
  在真核細(xì)胞中，lncrna的功能與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)。為了表征miR663AHG在結(jié)腸癌細(xì)胞中的分布規(guī)律，我們采用qRT-PCR方法初步測(cè)定了miR663AHG在6種結(jié)腸癌細(xì)胞系中的基線表達(dá)狀態(tài)。miR663AHG水平在Caco2或SW620細(xì)胞中高于HCT116或RKO細(xì)胞，在SW480和LoVo細(xì)胞中較低。同樣，miR663a水平在SW620細(xì)胞中較高，在SW480細(xì)胞中較低(數(shù)據(jù)未顯示)。RNA-FISH分析結(jié)果顯示，miR663AHG位于結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，主要位于Caco2和HCT116細(xì)胞的細(xì)胞核中，以及SW480細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。在LoVo細(xì)胞中未檢測(cè)到miR663AHG雜交信號(hào)。
  
  miR663AHG在體內(nèi)外均抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移
  
  為了研究miR663AHG的生物學(xué)功能，我們將miR663AHG基線表達(dá)水平較低的兩株人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和LoVo穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR663AHG慢病毒表達(dá)載體，而將miR663AHG基線表達(dá)水平較高的另外兩株細(xì)胞株SW620和HCT116轉(zhuǎn)染針對(duì)miR663AHG (si663AHG)的sirna。在長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察分析中，miR663AHG過(guò)表達(dá)顯著抑制SW480和LoVo細(xì)胞的增殖，而miR663AHG敲低則顯著促進(jìn)SW620和HCT116細(xì)胞的增殖。miR663AHG過(guò)表達(dá)和敲低也誘導(dǎo)了類似的集落形成率差異，這些結(jié)果在動(dòng)物模型中得到了證實(shí)。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR663AHG的RKO細(xì)胞衍生的異種移植物生長(zhǎng)明顯慢于空對(duì)照細(xì)胞(P = 0.009)。
  
  miR663AHG在結(jié)腸癌中的下調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)
  
  我們之前報(bào)道了miR663a在結(jié)腸癌組織(CCs)中的表達(dá)相對(duì)于患者匹配的手術(shù)邊緣對(duì)照(SMs)顯著下調(diào)。有足夠RNA樣本用于miR663AHG檢測(cè)的患者(n = 119)被重新納入本研究。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，與SMs相比，miR663AHG在cc中的表達(dá)顯著下調(diào)，特別是在有淋巴轉(zhuǎn)移或pTNM晚期或分化良好的cc中。
  
  miR663AHG在不同臨床病理特征患者結(jié)腸癌組織樣本中的表達(dá)水平
  
  Kaplan-Meier分析顯示，miR663AHG低表達(dá)(低于中位數(shù))結(jié)腸癌患者的總生存期(OS)顯著短于miR663AHG高表達(dá)患者(P = 0.018)。單因素分析顯示，4個(gè)危險(xiǎn)因素與這些患者的OS顯著相關(guān)。這些因素包括miR663 AHG低表達(dá)(風(fēng)險(xiǎn)比[HR]， 2.026;95%可信區(qū)間[CI]， 1.113-3.689)、pTNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。然而，在多變量分析中，只有轉(zhuǎn)移狀態(tài)與患者的OS顯著相關(guān)，而miR663AHG水平與患者的OS無(wú)關(guān)。
  
  此外，結(jié)合我們之前報(bào)道的miR663a數(shù)據(jù)，我們分析了這些結(jié)腸組織中miR663AHG和miR663a水平的相關(guān)性(n = 182;包括短信和短信)。兩者呈正相關(guān)(r = 0.179, P = 0.015)，表明miR663a可能參與miR663AHG的生物學(xué)功能。此外，我們還使用公共微陣列數(shù)據(jù)集分析了相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)353例卵巢癌樣本之間存在類似的相關(guān)性(Spearman r = 0.168, P = 0.002)。
  
  miR663AHG結(jié)合miR663a及其前體，保護(hù)miR663a靶標(biāo)
  
  為了探索miR663AHG在結(jié)腸癌發(fā)展中抑制作用的潛在潛在機(jī)制，我們使用StarBase v3.0數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。我們發(fā)現(xiàn)miR663AHG可能直接順式結(jié)合miR663a前體pre-miR663a(和pri-miR663a)。正如預(yù)期的那樣，RNA下拉分析結(jié)果顯示，生物素標(biāo)記的miR663AHG確實(shí)與RKO細(xì)胞中的pre-miR663a(和pri-miR663a)結(jié)合，生物素標(biāo)記的pre-miR663a也與miR663AHG結(jié)合。此外，生物素標(biāo)記的miR663a在RKO細(xì)胞中也顯著富集miR663AHG。這些結(jié)果證實(shí)了miR663AHG可以直接結(jié)合miR663a及其前體。
  
  在機(jī)制上，我們發(fā)現(xiàn)miR663AHG(或miR663a)表達(dá)的改變，無(wú)論是通過(guò)表達(dá)載體還是抗氧化白藜蘆醇處理誘導(dǎo)，都可以逆轉(zhuǎn)內(nèi)源性miR663a(或miR663AHG)表達(dá)的改變，表明miR663AHG基因表達(dá)存在負(fù)反饋回路。然而，miR663AHG和miR663a都是由相同的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物拼接而成。miR663AHG和miR663a在人體組織中表達(dá)的上述正相關(guān)表明，miR663AHG基因的轉(zhuǎn)錄活性應(yīng)該是決定miR663AHG和miR663a在人體細(xì)胞中表達(dá)水平的主導(dǎo)因素，盡管它們的確切表達(dá)水平和生物學(xué)功能是相互負(fù)相關(guān)的。
  
  綜上所述，我們的研究表明，lncRNA miR663AHG與miR663a及其前體pre-miR663a結(jié)合，誘導(dǎo)miR663a表達(dá)的負(fù)反饋。miR663AHG可能通過(guò)與miR663a及其前體的順式結(jié)合，在宿主對(duì)炎癥的防御反應(yīng)和抑制結(jié)腸癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
  
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